大家好，今天跟大家分享一篇题为SIRT3-PINK1-PKM2 axis prevents osteoa rthritis viamito chondrial renewal and metabolic switch（SIRT3-PINK1-PKM2轴通过线粒体更新和代谢转换预防骨关节炎）骨关节炎（OA）与软骨细胞线粒体稳态失衡密切相关。研究表明，PINK1通过促进线粒体自噬清除受损线粒体，其基因缺失加剧软骨退化；SIRT3通过去乙酰化PINK1激活该通路，并调控PKM2四聚体形成，驱动能量代谢向氧化磷酸化转换。
01
研究背景
维持线粒体稳态对于保持软骨细胞生理状况和增加对骨关节炎 （OA） 的抵抗力至关重要。然而，控制线粒体自我更新和能量产生的潜在机制仍然难以捉摸。在这项研究中，我们证明了 OA 软骨细胞中的线粒体损伤和异常线粒体自噬。
基因过表达 PTEN 诱导的推定激酶 1 （PINK1） 通过去除有缺陷的线粒体来防止软骨变性。PINK1 敲除加重了由于线粒体自噬受损而导致的软骨损伤。SIRT3 直接去乙酰化 PINK1 以促进线粒体自噬和软骨合成代谢。具体而言，PINK1 在 Ser127 位点磷酸化 PKM2，保留其活性四聚体形式。
这抑制了核转位和与 β-catenin 的相互作用，导致代谢转变和能量产生增加。最后，双基因敲除小鼠模型证明了 SIRT3-PINK1-PKM2 轴在保护关节结构完整性和改善运动功能方面的作用。总体而言，本研究为 OA 中线粒体更新和代谢转换的调节提供了新的见解。
见图一
线粒体损伤和适应不良的线粒体自噬与 OA 进展有关。
图一
a 用不同浓度的白细胞介素-1β （IL-1β） 处理软骨细胞，并对线粒体外膜 20 （TOMM20） 转位酶进行染色，以测量线粒体分支长度和足迹。在高度智能和灵敏的 SIM （HIS-SIM） 系统上使用 100 倍、1.5 NA 油浸物镜捕获图像，随后使用维纳反卷积进行处理。使用线粒体网络分析 （MiNA） 工具集 （n = 5） 对线粒体的分支长度和足迹进行量化。
b 使用 JC-1 染色和荧光显微镜在 IL-1β 处理的软骨细胞 （n = 3） 中评估线粒体膜电位 （MMP）。
c 分析 IL-1β 处理的软骨细胞 （n = 3） 中 mitoROS 的代表性荧光。
d 使用免疫荧光对线粒体和 PINK1 进行共染色 （n = 3）。
e 评估 LC3B 和溶酶体在 IL-1β 处理的软骨细胞中的共定位 （n = 3）。
f IL-1β 处理的软骨细胞中线粒体、线粒体和溶酶体共定位的分析 （n = 3）。
g、h 苏木精和伊红 （H&E） 和番红 O （S.O.） 术后 4、 8 和 12 周假小鼠的假染色和内侧半月板 （DMM） 不稳定。
i 通过 Sham 和 DMM 小鼠免疫荧光获得 IL-1β 阳性软骨细胞的体内代表性图像。
j 假小鼠和 DMM 小鼠中 PINK1 和 PRKN 阳性软骨细胞的体内免疫荧光代表性图像。这些值表示平均值±标准差 （SD）。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图二
靶向 PINK1 激活了线粒体自噬，以消除有缺陷的线粒体并促进线粒体自我更新。
图二
a 蛋白质水平确认小鼠的 Pink1 敲除。
b， c Pink1 耗竭下调参与线粒体自噬途径的蛋白质 （n = 3）。
d 线粒体自噬荧光表明 Pink1 缺陷后线粒体自噬活性降低 （n = 3）。
e Pink1 过表达后小鼠软骨细胞的透射电子显微镜 （TEM） 图像 （n = 3）。
f 通过 Pink1 缺陷后 TOMM20 免疫荧光测量线粒体分支长度和足迹 （n = 5）。Pink1 缺失后小鼠软骨细胞的 g TEM 图像 （n = 3）。Pink1 缺陷后 h MMP 变化 （n = 3）。
i 在 AAV 介导的 Pink1 在关节腔中过表达后，PINK1-PRKN 轴相关蛋白阳性的细胞增加。
j 敲除 Pink1 后 PINK1-PRKN 轴相关蛋白阳性的细胞减少。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图三
Pink1 的基因过表达或整体敲除影响软骨稳态和 OA 发展。
图三
a、b Pink1 过表达后 COLII、ACAN、MMP13 和 ADAMTS5 蛋白水平的蛋白质印迹分析 （n = 3）。
c、d Pink1 缺陷后 COLII、ACAN、MMP13 和 ADAMTS5 蛋白水平的蛋白质印迹分析 （n = 3）。
e、f 分别在 Pink1 过表达和缺陷的情况下对 COLII 或 MMP13 进行细胞免疫荧光。
g、h Pink1 敲除后 H&E 和 S.O. 染色的代表性图像。
i、j 国际骨关节炎研究学会 （OARSI） 评分和透明软骨 （HC） 与钙化软骨 （CC） 比率的定量分析 （n = 5）。
k 比较野生型和 Pink1 敲除 （Pink1） 的显微计算机断层扫描 （μ-CT） 成像分析 （Pink1–/–） 小鼠手术前后。
l 野生型和 Pink1 小梁骨体积分数 （BV/TV） 的定量分析–/–小鼠 （n = 5）。野生型和 Pink1 的步态分析和步幅和足迹宽度的步态分析和量化–/–小鼠 （n = 6）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图四
SIRT3-PINK1 轴通过脱乙酰激活线粒体自噬和软骨合成代谢以抵消 OA。
图四
a Sirt3 敲除中的 SO 染色 （Sirt3–/–） 小鼠。
b-d 野生型和 Sirt3 体内 PINK1 或 PRKN 阳性软骨细胞的代表性图像和定量–/–小鼠 （n = 5）。
e 使用免疫共沉淀 （Co-IP） 测定法检测野生型和 Sirt3 缺陷型软骨细胞中 PINK1 的总蛋白含量和 PINK1 乙酰化水平。
f 使用 Co-IP 测定法检测野生型和 Sirt3 过表达软骨细胞中 PINK1 的总蛋白含量和乙酰化水平。si Pink1 转染会减少 g SIRT3 诱导的线粒体自噬。
h， i siPink1 转染后受损的 SIRT3 介导的线粒体长度和足迹改善 （n = 5）。
j， k siPink1 转染后 SIRT3 介导的 MMP 改善受损 （n = 3）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图五
Pink1 的过表达改善了 Sirt3 敲除引起的线粒体自噬的减少，从而阻碍了 OA 的进展。
图五
a Sirt3 敲除中的 SO 染色 （Sirt3–/–） AAV 介导的 Pink1 过表达后的小鼠。
b μ-CT 影像学分析比较 Sirt3–/–过表达 Pink1 前后的小鼠。
c Sirt3 的步态分析–/–过表达 Pink1 前后的小鼠。
d Sirt3 的 PINK1 或 PRKN 阳性软骨细胞的体内免疫荧光代表性图像–/–过表达 Pink1 前后的小鼠。
e SIRT3 诱导的线粒体自噬通过过表达 Pink1 来挽救。在 Pink1 过表达后，通过 TOMM20 免疫荧光在 Sirt3 敲除细胞中测量线粒体长度和足迹 （n = 5）。过表达 Pink1 后 Sirt3 敲除细胞的 h MMP 变化 （n = 3）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图六
PINK1 直接磷酸化 PKM2 并抑制其核转位以促进能量产生。
图六
a Pink1 缺失和过表达对 PKM2 蛋白水平以及 Tyr370 和 Ser37 磷酸化的影响。
b、c PINK1 调节后 PKM2 和 β-catenin 核易位的免疫荧光评估。
d 野生型和 Pink1 中 PKM2 蛋白分布的定量分析–/–使用核质分级分离的小鼠。
e 评估 PINK1 过表达和 siPink1 处理后 PKM2 和 β-catenin 的核质分布。
f 使用 Co-IP 测定法敲除 Pink1 后 PKM2 和 β-catenin 之间的相互作用。
g 观察 Sirt3 过表达或敲低后 PKM2 和 PINK1 的共定位。
h OA 患者健康或受损软骨组织中 PKM2 和 SIRT3 的蛋白水平。
i 分析三个磷酸化位点（Ser127、Ser287 和 Thr365）的 PKM2 突变通过核质组分分离对其亚细胞分布的影响。j Pink1 过表达或敲除后的细胞外酸化率 （ECAR） 分析 （n = 3）。
k Sirt3 过表达和随后的 siPink1 转染后的 ECAR 分析 （n = 3）。
l Ser127 磷酸化位点的 PKM2 突变对野生型、PINK1 过表达和 PINK1 缺陷型软骨细胞 ECAR 水平的影响 （n = 3）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计显着差异。
02
研究结论
这项研究有两个缺点。首先，使用整体基因敲除小鼠评估 SIRT3-PINK1 轴在 OA 进展中的意义;因此，不能排除这种干预对其他组织的影响。随后的研究应使用具有软骨特异性缺失的小鼠模型来阐明 SIRT3-PINK1-PKM2 轴在软骨细胞稳态中的特定作用。其次，我们发现 PINK1 修饰的 PKM2 磷酸化位点可以引发对比效应，导致形成二聚体或四聚体。然而，需要进一步的研究来阐明 PINK1 与 PKM2 上特定位点选择性结合的潜在机制和基本原理。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
维持线粒体稳态对于保持软骨细胞生理状况和增加对骨关节炎 （OA） 的抵抗力至关重要。然而，控制线粒体自我更新和能量产生的潜在机制仍然难以捉摸。在这项研究中，我们证明了 OA 软骨细胞中的线粒体损伤和异常线粒体自噬。
基因过表达 PTEN 诱导的推定激酶 1 （PINK1） 通过去除有缺陷的线粒体来防止软骨变性。PINK1 敲除加重了由于线粒体自噬受损而导致的软骨损伤。SIRT3 直接去乙酰化 PINK1 以促进线粒体自噬和软骨合成代谢。具体而言，PINK1 在 Ser127 位点磷酸化 PKM2，保留其活性四聚体形式。
这抑制了核转位和与 β-catenin 的相互作用，导致代谢转变和能量产生增加。最后，双基因敲除小鼠模型证明了 SIRT3-PINK1-PKM2 轴在保护关节结构完整性和改善运动功能方面的作用。总体而言，本研究为 OA 中线粒体更新和代谢转换的调节提供了新的见解。
见图一
线粒体损伤和适应不良的线粒体自噬与 OA 进展有关。
图一
a 用不同浓度的白细胞介素-1β （IL-1β） 处理软骨细胞，并对线粒体外膜 20 （TOMM20） 转位酶进行染色，以测量线粒体分支长度和足迹。在高度智能和灵敏的 SIM （HIS-SIM） 系统上使用 100 倍、1.5 NA 油浸物镜捕获图像，随后使用维纳反卷积进行处理。使用线粒体网络分析 （MiNA） 工具集 （n = 5） 对线粒体的分支长度和足迹进行量化。
b 使用 JC-1 染色和荧光显微镜在 IL-1β 处理的软骨细胞 （n = 3） 中评估线粒体膜电位 （MMP）。
c 分析 IL-1β 处理的软骨细胞 （n = 3） 中 mitoROS 的代表性荧光。
d 使用免疫荧光对线粒体和 PINK1 进行共染色 （n = 3）。
e 评估 LC3B 和溶酶体在 IL-1β 处理的软骨细胞中的共定位 （n = 3）。
f IL-1β 处理的软骨细胞中线粒体、线粒体和溶酶体共定位的分析 （n = 3）。
g、h 苏木精和伊红 （H&E） 和番红 O （S.O.） 术后 4、 8 和 12 周假小鼠的假染色和内侧半月板 （DMM） 不稳定。
i 通过 Sham 和 DMM 小鼠免疫荧光获得 IL-1β 阳性软骨细胞的体内代表性图像。
j 假小鼠和 DMM 小鼠中 PINK1 和 PRKN 阳性软骨细胞的体内免疫荧光代表性图像。这些值表示平均值±标准差 （SD）。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图二
靶向 PINK1 激活了线粒体自噬，以消除有缺陷的线粒体并促进线粒体自我更新。
图二
a 蛋白质水平确认小鼠的 Pink1 敲除。
b， c Pink1 耗竭下调参与线粒体自噬途径的蛋白质 （n = 3）。
d 线粒体自噬荧光表明 Pink1 缺陷后线粒体自噬活性降低 （n = 3）。
e Pink1 过表达后小鼠软骨细胞的透射电子显微镜 （TEM） 图像 （n = 3）。
f 通过 Pink1 缺陷后 TOMM20 免疫荧光测量线粒体分支长度和足迹 （n = 5）。Pink1 缺失后小鼠软骨细胞的 g TEM 图像 （n = 3）。Pink1 缺陷后 h MMP 变化 （n = 3）。
i 在 AAV 介导的 Pink1 在关节腔中过表达后，PINK1-PRKN 轴相关蛋白阳性的细胞增加。
j 敲除 Pink1 后 PINK1-PRKN 轴相关蛋白阳性的细胞减少。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图三
Pink1 的基因过表达或整体敲除影响软骨稳态和 OA 发展。
图三
a、b Pink1 过表达后 COLII、ACAN、MMP13 和 ADAMTS5 蛋白水平的蛋白质印迹分析 （n = 3）。
c、d Pink1 缺陷后 COLII、ACAN、MMP13 和 ADAMTS5 蛋白水平的蛋白质印迹分析 （n = 3）。
e、f 分别在 Pink1 过表达和缺陷的情况下对 COLII 或 MMP13 进行细胞免疫荧光。
g、h Pink1 敲除后 H&E 和 S.O. 染色的代表性图像。
i、j 国际骨关节炎研究学会 （OARSI） 评分和透明软骨 （HC） 与钙化软骨 （CC） 比率的定量分析 （n = 5）。
k 比较野生型和 Pink1 敲除 （Pink1） 的显微计算机断层扫描 （μ-CT） 成像分析 （Pink1–/–） 小鼠手术前后。
l 野生型和 Pink1 小梁骨体积分数 （BV/TV） 的定量分析–/–小鼠 （n = 5）。野生型和 Pink1 的步态分析和步幅和足迹宽度的步态分析和量化–/–小鼠 （n = 6）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图四
SIRT3-PINK1 轴通过脱乙酰激活线粒体自噬和软骨合成代谢以抵消 OA。
图四
a Sirt3 敲除中的 SO 染色 （Sirt3–/–） 小鼠。
b-d 野生型和 Sirt3 体内 PINK1 或 PRKN 阳性软骨细胞的代表性图像和定量–/–小鼠 （n = 5）。
e 使用免疫共沉淀 （Co-IP） 测定法检测野生型和 Sirt3 缺陷型软骨细胞中 PINK1 的总蛋白含量和 PINK1 乙酰化水平。
f 使用 Co-IP 测定法检测野生型和 Sirt3 过表达软骨细胞中 PINK1 的总蛋白含量和乙酰化水平。si Pink1 转染会减少 g SIRT3 诱导的线粒体自噬。
h， i siPink1 转染后受损的 SIRT3 介导的线粒体长度和足迹改善 （n = 5）。
j， k siPink1 转染后 SIRT3 介导的 MMP 改善受损 （n = 3）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图五
Pink1 的过表达改善了 Sirt3 敲除引起的线粒体自噬的减少，从而阻碍了 OA 的进展。
图五
a Sirt3 敲除中的 SO 染色 （Sirt3–/–） AAV 介导的 Pink1 过表达后的小鼠。
b μ-CT 影像学分析比较 Sirt3–/–过表达 Pink1 前后的小鼠。
c Sirt3 的步态分析–/–过表达 Pink1 前后的小鼠。
d Sirt3 的 PINK1 或 PRKN 阳性软骨细胞的体内免疫荧光代表性图像–/–过表达 Pink1 前后的小鼠。
e SIRT3 诱导的线粒体自噬通过过表达 Pink1 来挽救。在 Pink1 过表达后，通过 TOMM20 免疫荧光在 Sirt3 敲除细胞中测量线粒体长度和足迹 （n = 5）。过表达 Pink1 后 Sirt3 敲除细胞的 h MMP 变化 （n = 3）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计学上的显着差异。
见图六
PINK1 直接磷酸化 PKM2 并抑制其核转位以促进能量产生。
图六
a Pink1 缺失和过表达对 PKM2 蛋白水平以及 Tyr370 和 Ser37 磷酸化的影响。
b、c PINK1 调节后 PKM2 和 β-catenin 核易位的免疫荧光评估。
d 野生型和 Pink1 中 PKM2 蛋白分布的定量分析–/–使用核质分级分离的小鼠。
e 评估 PINK1 过表达和 siPink1 处理后 PKM2 和 β-catenin 的核质分布。
f 使用 Co-IP 测定法敲除 Pink1 后 PKM2 和 β-catenin 之间的相互作用。
g 观察 Sirt3 过表达或敲低后 PKM2 和 PINK1 的共定位。
h OA 患者健康或受损软骨组织中 PKM2 和 SIRT3 的蛋白水平。
i 分析三个磷酸化位点（Ser127、Ser287 和 Thr365）的 PKM2 突变通过核质组分分离对其亚细胞分布的影响。j Pink1 过表达或敲除后的细胞外酸化率 （ECAR） 分析 （n = 3）。
k Sirt3 过表达和随后的 siPink1 转染后的 ECAR 分析 （n = 3）。
l Ser127 磷酸化位点的 PKM2 突变对野生型、PINK1 过表达和 PINK1 缺陷型软骨细胞 ECAR 水平的影响 （n = 3）。这些值代表 SD ±平均值。指示组之间的 P < 0.05 表示统计显着差异。
02
研究结论
这项研究有两个缺点。首先，使用整体基因敲除小鼠评估 SIRT3-PINK1 轴在 OA 进展中的意义;因此，不能排除这种干预对其他组织的影响。随后的研究应使用具有软骨特异性缺失的小鼠模型来阐明 SIRT3-PINK1-PKM2 轴在软骨细胞稳态中的特定作用。其次，我们发现 PINK1 修饰的 PKM2 磷酸化位点可以引发对比效应，导致形成二聚体或四聚体。然而，需要进一步的研究来阐明 PINK1 与 PKM2 上特定位点选择性结合的潜在机制和基本原理。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
